一、处理过程
要处理 SRR14879780 的 ChIP-seq 数据并进行基序分析(包括比对到参考基因组 hg38.fasta 和峰值调用),你可以按照以下步骤操作,并使用相应的代码。每个步骤会涉及一些常用的生物信息学工具,如 FastQC、Trim Galore、Bowtie2、samtools、MACS2 和 MEME-ChIP。
1. 准备环境
你需要先安装必要的工具,如 Bowtie2、samtools、MACS2 和 MEME-ChIP。你可以使用 conda
来安装这些工具:
# 使用conda安装工具
conda install -c bioconda fastqc trim-galore bowtie2 samtools macs2 meme
2. 下载数据
首先,下载你需要的原始 SRA 数据 和 hg38 参考基因组。
# 下载sra数据并转换为fastq文件
prefetch SRR14879780
fastq-dump SRR14879780.sra
fasterq-dump SRRxxxxxx #比 fastq-dump 更快速的工具,适用于大数据集。
# 下载hg38参考基因组并建立索引
wget https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz #下载hg38
gunzip GCF_000001405.40_GRCh38.p14_genomic.fna.gz #解压下载的fasta文件
samtools faidx hg38.fa #为fasta文件建立索引
less hg38.fa #查看fasta文件
3.截取使用到的参考数据
samtools faidx hg38.fa chr20 > hg38_chr20.fa #截取需要比对的部分参考序列
(可选)数据质量控制和修剪
在对数据进行处理前,先检查测序数据fastq的质量,使用 FastQC 进行质控分析:
# 质量控制
fastqc SRR14879780_1.fastq
# 使用Trim Galore修剪低质量reads
trim_galore --paired SRR14879780_1.fastq SRR14879780_2.fastq
4. 比对生成sam
为了将数据比对到参考基因组,你需要构建参考基因组的索引,然后和fastq比对生成sam。
bwa index hg38_chr20.fa # 为 使用到的参考数据hg38_chr20.fa建立索引
bwa mem -t 24 hg38_chr20.fa SRRxxxxxx.fastq > SRRxxxxxx_hg38_chr20.sam # 将 FASTQ 数据比对到 chr20中的序列生成sam文件
5.sam文件压缩为bam文件,然后为bam文件建立索引
samtools sort -@ 24 -o SRR_chr20.bam SRR_chr20.sam # 将sam文件压缩为bam文件
samtools index SRR_chr20.bam #为bam文件建立索引
(可选)使用picard去除重复数据
使用conda创建一个虚拟环境,在该虚拟环境中安装picard
picard MarkDuplicates I=input.bam O=output.bam M=marked_dup_metrics.txt
(可选)用 bedtools 移除 ENCODE 项目中定义的黑名单区域
这里的黑名单区域指的是适用于 hg38 基因组版本的 ENCODE 黑名单区域的 bed 文件,先去encode中下载黑名单区域的bed文件
bedtools intersect -v -a your_data.bam -b hg19-blacklist.bed > filtered_data.bam
(可选) bamCoverage生成标准化的覆盖度轨迹BigWig 文件
effectiveGenomeSize指的是有效基因组大小,
指的是在测序分析中用于正常化的基因组的可测序区域的总长度(以碱基对为单位)。有效基因组大小与基因组的物理大小不同,通常排除了重复序列、未测序区域、基因组黑名单区域等不可测序或不可靠的区域。对于人类基因组,常见的基因组版本的有效基因组大小如下:hg19: 2,733,156,957 bp;hg38: 2,916,115,550 bp
bamCoverage -b SRR14879760_chr20_NOP56_sorted.bam -o SRR14879760_chr20_NOP56_sorted.bw --normalizeUsing RPGC --effectiveGenomeSize 2914744149 --binSize 5
6. 峰值调用
使用 MACS2 对比对的 BAM 文件进行峰值调用,以识别可能的 G4 结构富集区域:
# 使用MACS2进行峰值调用
macs2 callpeak -t SRR14879780_sorted.bam -f BAM -g hs -n SRR14879780_peak --outdir peaks/ --keep-dup all --cutoff-analysis --qvalue 0.001
7.高置信度峰值集
- 使用 Bedtools 合并重复实验的峰值:为了确保峰值的可靠性,使用 Bedtools 的
intersect
命令合并三个重复实验(G4)或两个重复实验(R-loop)的峰值,生成高置信度的峰值集。
8. 绘制 Venn 图
- 使用 R 包 VennDiagram:将不同重复实验的峰值重叠区域通过 Venn 图进行可视化,展示不同条件下的峰值共现情况。
9. 统计学显著性测试
- 使用 GSuite HyperBrowser (v2.1.3):通过 Monte Carlo FDR (假发现率)测试,评估峰值集合间的重叠显著性。这个测试可以确认不同数据集之间的峰值重叠是否具备统计学意义。
10. 基序分析
使用 MEME-ChIP 对 MACS2 调用的峰值进行基序分析:
# 提取峰值顶点区域的序列
bedtools getfasta -fi GCF_000001405.40_GRCh38.p14_genomic.fna -bed peaks/SRR14879780_peak_peaks.narrowPeak -fo peaks/SRR14879780_peaks.fa
# 使用MEME-ChIP进行基序分析
meme-chip -oc motif_results/ peaks/SRR14879780_peaks.fa
bedtools getfasta:这是bedtools套件中的一个程序,用于从FASTA文件中提取与BED文件指定的区域相对应的序列。fi:指定输入的FASTA文件路径,bed:指定输入的BED文件路径,fo:指定输出的FASTA文件路径
meme-chip基序分析:可以使用在线工具MEME-ChIP - Submission form (meme-suite.org)
结果分析
- MACS2 输出文件:你会得到
.narrowPeak
文件,包含了调用到的峰值位点。 - MEME-ChIP 输出文件:你会在
motif_results/
目录下得到基序分析的结果,展示在G4区域内富集的序列基序。
总结:
以上步骤详细展示了如何处理 SRR14879780 的 ChIP-seq 数据,使用 hg38 参考基因组进行比对、峰值调用,以及对富集区域进行基序分析。
二、文章中对chip-seq处理的描述
这段描述了 G4 ChIP-seq 实验 的具体流程,以及后续的数据处理步骤。以下是它的详细解释:
1. 实验步骤:
- 固定和染色质剪切:使用交联固定(通常是使用甲醛等)稳定DNA和蛋白质之间的相互作用,然后对染色质进行超声或其他方式的剪切,使其成为可处理的小片段。
- Triton X-100 处理:在固定和剪切后,加入 0.25% Triton X-100 处理样品,并以 20,000 g 的离心力离心10分钟,以去除不溶性碎片。
- 免疫沉淀(IP):从剪切后的染色质中提取 12.5 μL 样品,并使用 800 ng BG4 抗体(特异性识别 G-四链体结构的抗体)进行免疫沉淀。
- 洗涤:使用含有 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、100 mM KCl 和 0.1% Tween-20 的洗涤缓冲液,在 37℃ 和 1,400 rpm 的旋转孵育器中洗涤捕获的染色质片段10分钟,以去除非特异性结合的物质。
- DNA 洗脱和反交联:捕获的DNA通过 TE缓冲液 和 蛋白酶K 洗脱,并通过 65℃ 反交联(去除蛋白质-DNA的交联),纯化得到的DNA。
- DNA 纯化:使用 苯酚-氯仿 提取法和 乙醇沉淀 方法进一步纯化 DNA。
2. 测序库构建和测序:
- 使用 NEBNext ultra II DNA library prep kit 为 Illumina 平台制备 G4 ChIP-seq 文库,文库质量通过 Agilent 生物分析仪 进行评估,最后在 NovaSeq 6000 上进行测序。
3. 数据处理:
- 比对:使用 Bowtie 1.1.2 将测序读数比对到人类基因组(UCSC hg38),仅允许唯一映射的读段,并且在每个150 bp长的读段中最多允许3个错配。
- 读段扩展和归一化:比对的读数扩展到200 bp,模拟片段的实际长度,然后将读数归一化为每百万映射的读数(reads per million, r.p.m.)。
- 峰值调用:使用 MACS2 工具(ChIP-seq 的峰值分析模型)调用G4信号的峰值,参数设置为默认,q-value(显著性阈值)为 0.001,以识别基因组中的显著富集区域。
4. 基序分析:
- 峰值扩展:为了进行基序(motif)分析,作者将已调用的G4 ChIP-seq峰值的顶点(峰值的中心)扩展50 bp,从这些区域提取DNA序列。
- MEME-ChIP:使用 MEME-ChIP(一种基序发现工具)对这些DNA序列进行分析,找出可能的特征基序(motif)。
总结:
该段描述了 G4 ChIP-seq 实验的整个过程,从样品制备、免疫沉淀到 DNA 纯化和测序库构建。接着介绍了如何使用 Bowtie 将测序数据比对到参考基因组,如何通过 MACS2 调用 G4 的富集区域(峰值),以及使用 MEME-ChIP 进行基序分析。这些步骤有助于识别基因组中可能形成 G-四链体结构的区域,并分析其功能。