今年2月份发表在《Nature Communications》（IF=14.4）的“TaTCP6 is required for efficientand balanced utilization of nitrate and phosphorus in wheat”揭示了TaTCP6在小麦氮磷利用中的关键调控作用，为优化肥料利用和提高作物产量提供了理论依据。
文章摘要
高作物产量需要充足的养分，特别是硝酸盐（N）和磷（P），因此确定小麦中有效利用氮-磷的调控因子至关重要。为了探究氮-磷之间的相互作用，作者分析了在不同氮-磷供应条件下的根系转录组，并鉴定出TaTCP6是一个潜在的调控因子。硝酸盐刺激的TaTCP6直接触发与氮利用相关基因的表达。TaTCP6与TaSPX1/4竞争以释放TaPHR2，并与TaPHR2相互作用，从而增强下游基因的转录活性。TaTCP6的双重作用使得TCP6-SPX-PHR2模块能够激活磷饥饿反应（PSR）基因。抑制TaTCP6会减少氮和磷的吸收，对产量产生负面影响，而过量表达TaTCP6则会增加谷物产量。值得注意的是，过量表达TaSPX1会抑制氮利用基因，特别是在低磷条件下。总之，研究结果突出了TaTCP6在协调氮和磷利用中的作用，并提出了一种减少肥料投入以实现可持续农业的策略。
研究背景：
氮（N）和磷（P）是作物生长必需的大量元素，研究作物如何协调氮磷利用对农业生产至关重要。此前相关研究多集中于水稻和拟南芥，小麦中的研究较少。TCP转录因子在植物生理过程中起重要作用，本研究聚焦于小麦中的TaTCP6，探究其在氮磷利用中的功能。
植物材料构建：
运用基因克隆、载体构建及农杆菌介导转化技术，获得TaTCP6、TaSPX1、TaPHR2等过表达和敲除材料。
实验设置：
水培实验设置不同N-P供应组合处理小麦幼苗；田间试验在不同地点设置正常和低N低P处理，观测小麦生长及产量相关指标，水稻则在自然稻田条件下于北京上庄实验站种植。
涉及技术：
采用RNA-seq、RT-qPCR、CUT&Tag、分裂荧光素酶互补成像（LCI）检测、双分子荧光互补（BiFC）、酵母单双杂交（Y1HY2H）、免疫共沉淀、亚细胞定位、双荧光素酶、电泳迁移率测定法（EMSA）、Pull-down等技术，分析基因表达、蛋白互作及DNA结合位点等。爱基百客为本研究提供了CUT&Tag的技术支持。
技术路线
主要结果
结果一：硝酸盐同时激活氮和磷利用相关基因，以协同调控氮和磷的利用
为了探讨小麦中氮和磷的协调调控，作者在水培条件下培养了不同氮磷供应组合的幼苗：高硝酸盐(HN，2.5mM硝酸钾）；低硝酸盐(LN，0.25mM硝酸钾）；高磷酸盐(HP，0.3mM磷酸一钾）；低磷酸盐（LP，0.03mM磷酸一钾）。在LN和LP条件下，根生物量显著增加（图1a、b）。在HN条件下，磷酸盐的施用促进了生物量的增长，而在LN条件下则影响不明显，这表明氮的充足对磷的有效利用至关重要。对不同N-P条件下的小麦根进行转录组测序，在HN和LN条件下，分别鉴定出由LP诱导的4710个和149个差异表达基因（DEGs）（图1c)。而PSR基因多数仅在高氮低磷的环境中高表达，说明氮的供给对于磷饥饿反应是必需的。在LP条件下，硝酸盐处理引发的DEGs数量大幅减少（5251个），而HP条件下的DEGs数量则较多（8864个）（图1d)。硝酸盐主要在处理6小时后刺激氮利用相关基因的表达，短期和长期响应分析揭示了部分基因的共同反应。
图1：硝酸盐对小麦的硝酸盐和磷反应是必不可少的
结果二：硝酸盐刺激的TaTCP6正向调节硝酸盐的吸收和利用
TaNRT2.1的表达受磷水平的显著影响（图1g），这表明TaNRT2.1的启动子中存在调控氮或磷的核心顺式作用元件。为了探究参与硝酸盐促进氮磷利用过程的调控因子，
以TaNRT2.1启动子为诱饵进行酵母单杂交筛选，并通过电泳迁移率变动分析（EMSA）实验证实了TaTCP6与TaNRT2.1启动子之间的直接相互作用（图2b、c、k）。硝酸盐可刺激TaTCP6的转录，在处理后4-6小时达到峰值（图2d）鉴定出TaTCP6。与此一致的是，小麦原生质体实验表明，在高氮（HN）条件下，TaTCP6的蛋白质丰度显著增加（图2e）。为了进一步研究TaTCP6的功能，构建了过表达株系TaTCP6-OE，结果显示，在TaTCP6过表达株系TaTCP6-OE中，这些基因大多显著上调（图2h）。TaTCP6-SRDX幼苗的硝酸盐吸收能力显著降低（图2g）。瞬时荧光素酶活性分析表明，TaTCP6能在TaNRT1.1、TaNIA1和TaNIR1的启动子驱动下显著激活荧光素酶LUC（图2j）。电泳迁移率变动分析（EMSA）显示，TaTCP6能直接结合这些基因的启动子（图2k）。综上所述，表明TaTCP6对硝酸盐水平有响应，并正向调控硝酸盐的吸收和利用。
图2：TaTCP6由硝酸盐诱导，参与小麦硝酸盐的利用
结果三：TaTCP6调控小麦和水稻关键农艺性状
为了确定TaTCP6及其在水稻中的同源基因OsTCP6是否对田间产量有贡献，研究人员于2023年在北京进行了田间试验。过表达TaTCP6会导致株高（PH）和千粒重（TGW）显著增加，而在TaTCP6-SRDX株系中，这些性状则显著降低（图3a-c）。总之，过表达TaTCP6可增加小麦株高、千粒重和分蘖数，提高产量；其水稻同源基因OsTCP6功能类似，说明TaTCP6对作物产量至关重要。
图3：小麦的TaTCP6对植物高度和粮食产量有正向调节作用
结果四：TaTCP6靶基因的鉴定
为了更好地理解TaTCP6促进营养利用的机制，对五个不同TaTCP6过表达水平的株系进行了转录组分析。对具有较多DEGs的TaTCP6-OE-3/4/5/6株系进行了进一步分析。在至少三个株系中共鉴定出11,818个DEGs，其中8421个DEGs在这四个株系中重叠（图4a）。其中，554个是氮调控基因（图4b）。接下来，通过CUT&Tag实验测序鉴定TaTCP6在小麦基因组上的共鉴定出85,072个DNA结合位点。TaTCP6DNA结合位点的密度图显示，在基因主体区域有广泛的结合信号（图4c）。对TaTCP6CUT&Tag峰的基序分析揭示，GTGGGNCCCACC基序显著富集，这与先前报道的TBS高度一致（图4d）。基因组分布分析显示，这些峰在基因间区域高度富集，占所有峰的78.98%。其中，11.97%的峰（7764个基因）位于转录起始位点上游2kb的推定启动子区域（图4e）。在TaTCP6直接结合的基因中，有1,889个基因（16.0%）在Fielder和TaTCP6-OE之间存在差异表达，其中942个和947个基因分别上调和下调（图4f）。GO分析表明，这些TaTCP6靶基因富集在与铁运输、激素响应、幼苗发育、葡萄糖响应和硝酸盐响应相关的生物学过程中（图4g）。igv可视化在TaNRT2.1-6B4、TaNRT1.1B、TaNIA1-6B1、TaNIR-6B1、TaGS-4A1和TaGOGAT-3A1等氮利用相关基因的启动子区域存在特定的TaTCP6结合峰（图4h）。TaNLP3-3D、TaNLP4-5D、TaNAC2-3B、TaZnF-4B、TaSPX4-5D和TaBZR2-3A等几个氮利用和植物生长的关键调控基因，在其启动子中也表现出特定的TaTCP6结合峰（图4i）。EMSA证实TaTCP6在体外与TaNAC2-3B、TaNLP4-5D和TaSPX4-5D的启动子直接结合（图4j）。重要的是，这些基因在TaTCP6过表达株系中均上调（图4k）。结果表明，TaTCP6通过直接调控相关关键基因，控制硝酸盐的吸收、同化和小麦的发育。
图4：全基因组范围内识别TaTCP6转录因子的结合基序
结果五：TaTCP6参与磷吸收利用
通过分析OsTCP19过表达水稻中OsPht1;2的抑制和TaTCP6对转基因植物籽粒磷含量的影响。结果显示，TaTCP6过表达系中与磷摄取相关的基因表达显著增强（图5a），磷（Pi）含量也显著增加（图5b）。相反，敲除OsTCP6显著降低了水稻对磷酸盐的吸收率。为探讨TaTCP6的功能，利用Y2H筛选出多个GARP家族转录因子，包括关键的磷酸盐饥饿反应调节因子TaPHR2。这些GARP转录因子在营养和激素响应中发挥重要作用，并与TaTCP6的MYB结构域相互作用（图5c-e）。通过双分子荧光互补（BiFC），共免疫沉淀（Co-IP），下拉和LCI进一步验证了TaTCP6在细胞核中与TaRLI1和TaPHR2相互作用（图5f-i）。
图5：TaTCP6与TaPHR2相互作用
结果六：TaTCP6与TaSPXs竞争，以中断TaPHR2与TaSPXs的相互作用
由于含有SPX结构域的蛋白在PSR的抑制中起着重要作用，并且通过Y2H筛选得到了鉴定，因此作者研究了TaTCP6与TaSPX之间的相互作用。有趣的是，TaTCP6与TaSPX之间的相互作用主要局限于细胞核，而TaSPX与TaPHR2和TaRLI1之间的相互作用受TaSPX亚细胞定位的影响（图6a）。Co-IP、pull-down和LCI进一步证实TaTCP6能够与TaSPX1和TaSPX4相互作用（图6b-d）。小麦原生质体中的瞬时表达实验表明，TaSPX4能将TaPHR2封闭在细胞质中。然而，TaTCP6的存在会导致TaPHR2释放到细胞核中（图6e）。
图6：TaTCP6封存TaSPXs以释放PHR2
结果七：TaTCP6与TaPHR2相互作用并增强其活性，从而启动磷饥饿反应
为了确定与TaTCP6的相互作用是否会影响TaPHR2的转录激活能力，研究人员在小麦原生质体中进行了瞬时表达测定。结果显示，TaPHR2对磷饥饿响应（PSR）基因的启动子。此外，TaTCP6显著恢复了由TaSPX1导致的TaPHR2受损的转录激活活性（图7b、c）。研究人员进一步证明，TaTCP19、TaPCF3和TaTCP9对TaPHR2的转录激活能力有不同影响。特别是，与TaTCP6相反，TaTCP19表现出明显的抑制作用（图7b、c）。这些结果表明，硝酸盐供应通过上调TaTCP6和下调TaTCP19的表达，促进了TaPHR2的转录激活能力，从而增强了磷的吸收和利用。同样地，过表达TaPHR2促进了PSR基因的表达，并增加了无机磷（Pi）含量（图7e、f）。进一步的定量分析显示，TaPHR2-OE×TaTCP6-SRDXT1代植株中的Pi含量显著低于TaPHR2-OE小麦植株（图7g），这可能主要归因于TaTCP6-SRDX对OsPHR2活性的抑制。总之，这些结果表明TaTCP6可以通过提高TaPHR2的活性来促进小麦中Pi的积累。
图7：TATCP6促进了TAPHR2的转录激活能力
结果八：在低磷条件下，TaSPX1参与对氮利用基因的抑制
RT-qPCR显示，在TaSPX1过表达株系中，氮利用基因的转录受到显著抑制，且这种抑制在低磷（LP）条件下更为明显（图8a-c）。小麦原生质体中本氏乳杆菌和BiFC测定法的LCI分析表明，低磷酸显著减弱了TaSPX1-TaPHR2相互作用，但对TASPX1与TATCP6的共轭作用没有影响（图8d，e）。TANAC2，TANLP4和TASPX4在TATCP6-OE×TASPX1T1植物中的表达显着降低，表明TASPX1抑制了TATCP6的活性，从而损害了其激活硝基激素利用基因的功能（图8f）。总体而言，作者的研究揭示了氮利用基因表达的低磷酸化抑制作用以及氮摄取和利用的基础机制。
图8：低磷酸通过增强的TASPX-TATCP6相互作用抑制原发性硝酸盐反应
结果九：TATCP6有助于氮和磷饥饿适应，并显着提高了田间的产量
在石家庄的正常田间条件（NN&NP）和低氮低磷条件（LN&LP）（图9a）以及北京的正常田间条件下，作者对模拟品系和转基因品系TaTCP6-OE-2/5和TaTCP6-SRDX-1/2的表现进行了田间试验评估。并且测定了各种农艺性状，如株高、分蘖数和每穗粒数。结果显示在LN和LP条件下均有显著下降，而千粒重与NN&NP条件下相比无显著差异，甚至有所增加（图9g，h）。TaTCP6-OE-2/5在NN&NP和LN&LP两种条件下均显著增加了有效分蘖数（图9b、e-g）。TaTCP6表达量处于中等水平的TaTCP-OE-2株系，在NN&NP条件下株高更高，千粒重也更高；而在LN&LP条件下，每穗粒数更多，但千粒重相对较低（图9b、e-g）。在NN&NP条件下，TaTCP6-SRDX的过表达严重影响了小麦的生长，随着表达水平的增加，影响也越大。但在LN&LP条件下，这种影响有所减弱（图9d、e、f、h）。综合这些结果来看，在田间NN&NP和LN&LP条件下，将TaTCP6提高到最佳水平可显著提高谷粒产量。
图9：在正常和氮磷缺乏的田间条件下，TaTCP6转基因植物的表型
讨 论
在不同硝酸盐和磷浓度下，由TaTCP-TaPHR2-TaSPX模块协调的硝酸盐和磷吸收平衡模型。在氮水平升高的情况下，TaTCP6的表达会大幅增加。已证实该蛋白能直接结合并促进氮利用基因（NUG）的表达。此外，TCP6表达的增加还会与TaPHR2和TaSPXs相互作用，从而促进与磷饥饿响应（PSR）相关基因的表达。相反，在低磷条件下，TaSPX1与TaPHR2的相互作用减弱，进而促进PSR基因（包括TaSPXs）的表达。大量表达的TaSPXs会被迫与TaTCP6和TaNLPs相互作用，以抑制氮利用基因的表达(图10)。
图10：不同硝酸盐和磷浓度下由TaTCP-TaPHR2-TaSPX模块协调的硝酸盐和磷吸收平衡模型。
总 结
文章通过水培、田间实验及多种分子生物学技术，研究小麦氮磷利用机制，发现硝酸盐可激活氮磷信号通路促进这两种物质的平衡利用。TaTCP6受硝酸盐诱导，正向调控硝酸盐吸收利用，还能与TaSPXs和TaPHR2相互作用，提高磷利用效率。低磷时TaSPX1抑制氮利用基因表达。TaTCP6过表达可显著增加产量，敲除则减产，表明其是氮磷吸收同化的核心调控因子，为可持续农业减少肥料投入提供了理论支撑。