如何做好DNA-SIP?

如何做好DNA-SIP?

1. 什么是SIP？
   它是稳定性同位素探针Stable isotope probing的首字母缩写。就是用稳定性同位素去标记研究对象，追踪稳定性同位素标记物去了哪里？去了多少？
2. 什么是DNA-SIP?
   DNA-SIP就是在脱氧核糖核酸的（DNA）某个元素或某几个元素上标记上该元素或那几个元素的同位素，来追踪代谢某种物质的生物。
   
3. 稳定性同位素有放射性吗？
   质子数相同、而中子数不同的一组元素被称为同位素。同位素间的差别就在于中子数不同，也就是体现在相对原子质量上。如13C是12C的稳定性同位素；15N是14N的稳定性同位素；42Ca, 43Ca, 44Ca，46Ca, 48Ca是40Ca的稳定性同位素。它没有衰变，没有放射性。
4. DNA基本知识
   DNA（脱氧核糖核酸）由碱基、脱氧核糖和磷酸组成。碱基一般有腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C），其分子量分别为347.22，363.22，323.21和322.21。碱基一般以A-T配对和G-C配对。A-T配对分子量为669.43，G-C配对为686.43。如果DNA中含有更多的G-C，那么DNA的重量就会更重，在离心后就会出现在离心管的高密度区，而含有更多A-T组合的DNA就会出现在离心管的低密度区，这样离心后DNA就发生了分层。
5. 用DNA-SIP追踪代谢某种物质基本原理
   在自然界中，由于合成化合物时同化轻的元素比同化重的元素需要更低的能量，生物为了减少能量消耗，一般都喜欢同化轻的元素。当用重的同位素替换轻的同种元素后，DNA就会变重，在离心后重的DNA和轻的DNA就会出现在不同的密度层，从而就能知道哪种生物同化了标记的化合物。
6. 如何做土壤动物和微生物DNA-SIP
   用稳定性同位素探针（stable isotope probing-SIP）技术研究物质转化的土壤动物和微生物时，最重要的是标记生物的DNA和未标记的在超高速离心后发生分层，否则就失败了。DNA一般由腺嘌呤（A-adenine）、鸟嘌呤（G-guanine）、胞嘧啶（C-cytosine）和胸腺嘧啶（T-thymine）组成。DNA中一般含氮15.5%，含碳34.5%。在未标记情况下，DNA超高速离心后密度介于1.69到1.74。如果超高速离心后分为15层，意味着层间DNA密度差为（1.74-1.69）/15=0.00333。如果分为32层，则为0.00156。常规DNA的分子量为1355.86。如果标记后DNA与未标记DNA发生分层，那么DNA密度至少要增加0.00156_{0.00333。如果用15N标记，DNA中15N原子数必须大于N总原子数的15%}30%。如果用13C标记，DNA中13C原子数必须大于C总原子数的5-10%。要实现好的研究结果，分层2层以上为好。也就是说DNA中15N丰度要达到30%以上，而13C要达到10%以上。如果用标记秸秆加到土壤中，首先要知道土壤矿化速率，也就是土壤提高给微生物或动物的量，再根据秸秆利用率，确定好供试物13C或15N丰度和添加量，确保土壤动物和微生物中标记的DNA能达到15N 30%或13C 10%以上。
   实验案例：
   供试土壤微生物生物量为12.8mg DNA/kg soil，相当于DNA中含碳量12.834.5%=4.42mg。
   加入秸秆13C丰度为59.4%，加入量为每10g干土加入0.1g秸秆。假如秸秆含碳量为40%，则加入碳量为0.140%=0.04g=40mg。
   加入秸秆后微生物生物量增加到19.7mg/kg, 即DNA中含碳量为19.734.5%=6.8mg。
   假如增加的DNA碳中(6.8-4.4)=2.4mg中有20%来自秸秆，则DNA中碳的丰度=[2.420%59.4%+(6.8-2.420%)*1.1%]/6.8=5.2%.
   实验结果是离心后分层达2层以上，说明秸秆中有超过40%的碳来自秸秆（liu bj et al., 2021）。
   具体可请教有经验的老师、同事或经销商。
   Liu BJ, Bei QC, Wang XJ, Liu Q, Hu SJ, Lin ZB, Zhang YH, Lin XW, Jin HY, Hu TL, Xie ZB. Microbial metabolic efficiency and community stability in high and low fertility soils following wheat residue addition. Applied Soil Ecology, 159 (2021), 103848.