文章信息
题目：AcMYB1 Interacts With AcbHLH1 to Regulate Anthocyanin Biosynthesis in Aglaonema commutatum
刊名：Frontiers in Plant Science
作者：Ji Li, Songjun Zeng et al.
单位：South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences
日期：19 July 2022
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摘要
白柄粗肋草（银皇后）是最受欢迎的观叶植物之一，具有丰富的叶片表型；因此，花青素着色是A. commutatum的重要经济特征。然而，花青素生物合成及其调控的分子机制仍不清楚。在这项研究中，AcMYB1和AcbHLH1，分别与 R2R3-成髓细胞 (MYB) 和基本螺旋-环-螺旋 (bHLH) 相关的转录因子基因从A. commutatum “Red Valentine”中分离出来并进行了功能表征。通过 Y2H 分析发现 AcMYB1 和 AcbHLH1 存在相互作用。AcMYB1被归入 AN2 亚组，并与已知的花青素生物合成调节剂具有高度同源性。基因表达分析表明，AcMYB1和AcbHLH1与花青素结构基因具有相似的表达模式，并与花青素在A. commutatum不同组织中的分布有关。光照通过上调A. commutatum叶片中花青素相关基因的表达，强烈促进了花青素的积累。AcMYB1在烟草中的异位表达显着增加了不同发育阶段植物和生殖组织中花青素的积累。这些结果提供了对花青素生物合成调控的新见解，可用于培育具有增强观赏价值的新银皇后品种。
02
技术路线
03
主要结果
3.1 A. commutatum中花青素浓度的测定
A. commutatum 品种“红色情人节”的叶子呈白色，在叶子 S1 阶段保持卷曲。在叶子 S2 阶段，叶子颜色从白色变为浅粉色，在叶子 S3 阶段呈现深红色（图 1A）。A. commutatum叶片中的花青素含量随着发育年龄的增长而显着增加。此外，在根、茎和花中检测到痕量或未检测到花青素（图 1B）。
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3.2 AcMYB1和AcbHLH1的分离和序列分析
R2R3-MYB 和 bHLH TFs 是从A. commutatum 品种“红色情人节”的叶子转录组数据库中分离出来的。通过RACE PCR从A.commutatum叶片的cDNA中克隆候选基因后测序，并命名为AcMYB1和AcbHLH1。结果表明，AcMYB1和AcbHLH1分别含有969和2,115 bp的开放阅读框，分别编码322和712个氨基酸的蛋白质。邻接法的系统发育树显示，AcMYB1 与单子叶植物花青素调节剂聚集在一起，包括 AaMYB2、LhMYB6、LhMYB12 和 MaAN2（图 2A ）。类似地，AcbHLH1 与 AabHLH1 和其他与几种植物中花青素生物合成相关的 bHLH TF 形成一个簇（图 2B）。比对分析表明，AcMYB1 蛋白中包含一个高度保守的 R2R3 结构域，用于在 N 端结合 DNA，其在 R3 结构域中包含一个关键的 bHLH 相互作用基序，用于与 bHLH TF 相互作用（图 2C）。这些结果表明AcMYB1和AcbHLH1可能在花青素生物合成中相互作用并发挥作用。
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3.3 AcMYB1、AcbHLH1和花青素结构基因的表达水平
基因表达分析表明，包括AcMYB1和AcbHLH1在内的所有候选结构基因在三个叶片发育阶段的表达水平均显着高于其他组织，并在除AcF3H之外的叶片第二阶段达到峰值（图3）。此外，相关分析显示AcMYB1或AcbHLH1与结构基因之间的基因表达相关系数在0.73-0.99和0.75-0.98之间。这一结果表明AcMYB1和AcbHLH1的转录本丰度与大多数花青素结构基因的转录本丰度相关，它们可能参与调控花青素生物合成。
3.4 AcMYB1和AcbHLH1的亚细胞定位和蛋白质-蛋白质相互作用
拟南芥叶原生质体中的亚细胞定位分析表明，AcMYB1 和 AcbHLH1 均特异性定位在细胞核中（图 4）。在A. commutatum中，AcMYB1 和 AcbHLH1 显示出保守的相互作用基序、不同组织中相似的 mRNA 表达模式以及在细胞核中的共定位，表明可能存在相互作用。
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为了检验这个假设，我们使用了 Y2H 分析。对于 Y2H 测定，所有转化的菌落在 SD/-Leu/-Trp 上生长良好，表明它们成功转化。pGADT7-AcMYB1 + pGBKT7-AcbHLH1 的共转化菌落在 SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade 上显示出明显的蓝色，表明 AcMYB1 和 AcbHLH1 物理相互作用（图 5A）。这些结果进一步证实 AcbHLH1 和 AcbMYB1 可能在A. commutatum细胞中相互作用。
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3.5 烟草中AcMYB1的功能分析
调查AcMYB1的作用在调节花青素生物合成途径方面，在烟草中进行了在 CaMV-35S 启动子控制下的过表达（OE）。使用基因组 PCR 产生了 20 多个独立的转基因系。表型变化的结果表明，相对于对照植物，营养和生殖组织中的色素水平显着增加。特别是 OE-AcMYB1 系的叶片颜色发生了显着变化，转基因植物的成熟叶片显示出明显比对照植物更深的红色。此外，OE-AcMYB1 烟草的花冠颜色由浅粉色变为深红色，花药、花丝、花萼、子房壁和种皮中花青素积累明显增加（图 6A-L）。花青素含量测定证实，从OE-AcMYB1烟叶和花冠三个品系中提取的花青素明显高于对照（图6M，N）。
为了揭示 OE-AcMYB1 转基因植物中潜在的靶基因，通过 RT-PCR 分析验证了烟草叶片和花冠中结构基因和两个参与花青素生物合成的 bHLH TF 基因的 mRNA 表达水平。AcMYB1 的高表达水平首先通过 qRT-PCR 在三个系中得到证实（图 7A、B）。表达分析表明，与对照植物相比，所有三个转基因品系的叶片中的 11 个花青素调控基因均显着上调（图 7C）。然而，在三种转基因烟草植物的花冠中，只有NtCHI、NtANS、NtUFGT和NtAn1b的表达水平明显高于对照（图 7D ）。这些结果表明，AcMYB1可以上调或激活关键花青素结构基因和bHLH TFs的表达，最终促进转基因烟草中花青素的积累。
3.6 AcMYB1和AcbHLH1在本氏烟叶中的瞬时表达
进一步进行农杆菌介导的瞬时测定以研究 AcMYB1 和 AcbHLH1 对花青素生物合成的调节。结果表明，在接种对照或 AcbHLH1 构建体的叶子中检测到少量花青素积累，而在 AcMYB1 和 AcMYB1 + AcbHLH1 接种的叶子中观察到花青素斑块（图 8A-E）。AcMYB1 + AcbHLH1 叶片中的花青素含量是 AcMYB1 叶片的 1.36 倍（图 8E）。此外，花青素生物合成基因的表达在用 AcMYB1 和 AcMYB1 + AcbHLH1 构建体浸润的叶子中强烈上调（图 8F）。有趣的是，NbCHI、NbANS、NbDFR和NbUFGT在同时接种 35S:: AcMYB1和 35S:: AcbHLH1构建体时显示出显着高于仅用 35S::AcMYB1 浸润的表达水平。因此，我们预测 AcMYB1 在花青素调节中的能力可以通过与 AcbHLH1 的相互作用而增强。
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3.7 光照对A. commutatum基因表达和花青素积累的影响
对2年生A. commutatum “红情人节”幼苗在黑暗或光照条件下生长5天后进行比较分析。如图9A所示，光照处理植物的叶子颜色为鲜红色，而深色植物的叶子颜色为淡粉色。光照处理幼苗的叶片花青素含量比黑暗生长的幼苗高11.2倍（图9B）。此外，AcMYB1、AcbHLH1和10个花青素结构基因在光照条件下的转录水平均明显高于在黑暗条件下生长的幼苗（图9C）。结果表明，光可以强烈诱导A.commutatum “红色情人节”叶子中花青素相关基因的表达，促进花青素的积累。
04
结论
在这项研究中，新发现的 R2R3-MYB 和 bHLH 转录因子在A.commutatum叶子中被鉴定并命名为AcMYB1和AcbHLH1。表达模式分析表明，AcMYB1和AcbHLH1的转录本丰度与几个花青素结构基因相似，并与花青素分布相关。AcbHLH1 与 AcMYB1 相互作用形成转录复合物。此外，AcMYB1的过表达烟草中的花青素会导致烟叶和其他组织中的花青素过度积累，并上调花青素调控基因。此外，光照可以显着促进花青素积累，花青素相关基因在A. commutatum叶片中强烈上调。因此，我们认为AcMYB1是调节A. commutatum中花青素产生的关键基因。我们的研究可能有助于在观赏育种中改变叶片颜色，并为植物育种行业的进一步研究和开发提供基础。
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获取原文
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.886313/full
END
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