摘要
在运动序列学习过程中，眼跳(扫视)动作起着关键作用，这些眼跳帮助个体朝向目标并在到达目标之前收集所需的视觉信息。尽管以目标为导向的动作通常同时涉及眼睛和手部运动，但控制眼跳的脑区在运动序列学习过程中的作用仍不清楚。本研究旨在探讨眼动区域的静息态功能连接是否与运动序列学习所引发的行为变化相关。具体来说，本研究考察了眼动控制区域与其他涉及眼动控制和运动序列学习的候选区域之间的功能连接性。20名成年人在进行连续3天的运动任务练习之前和保留测试(用于评估序列特异性学习)后进行了脑部扫描，并在测试过程中追踪了眼跳和手部运动的轨迹。结果显示，在进行运动任务练习之前，多个眼动控制区域的连接强度与眼跳和手部运动的序列特异性学习程度呈正相关。随着运动任务训练的进行，眼动控制区域的功能连接性发生了显著的负向变化，这种变化与参与者在眼跳和手部运动等运动序列学习上的更好表现相关。总体而言，眼动功能连接与运动序列学习引发的行为变化密切相关，这为我们更好地理解眼动系统在运动序列学习过程中的作用提供了新的见解。
引言
运动技能学习是一个复杂的人类行为过程，涉及运动技能的获得和保持，对我们的日常生活至关重要。运动技能(如写字、驾驶或骑自行车)通过反复练习获得，并且会导致行为、大脑结构和功能的变化。涉及手指连续动作练习的任务，如序列反应时(SRT)任务，有助于我们理解与运动技能学习密切相关的神经基础和行为变化。虽然运动序列学习通常通过手部反应任务(如SRT)来评估，但这一学习过程不仅仅局限于手部的运动系统，还可能涉及其他身体部位或大脑区域。例如，眼动系统中也已证明存在序列性运动学习。关于眼动序列练习的神经影像学研究表明，负责眼跳控制的额叶和顶叶脑区在视觉刺激序列练习过程中表现出功能激活，但在非序列练习中则没有出现功能激活。尽管在眼动序列练习(没有手部运动的情况下)过程中已观察到额叶和顶叶眼动区域的功能激活，但目前尚不清楚这些额顶眼动区是否参与了包括手部动作在内的运动序列的获取和学习。我们对这一领域的理解有限，部分原因是：(1)缺乏对运动序列学习过程中眼动行为的全面评估；(2)缺乏对运动序列学习过程中参与眼动和肢体运动活动相关的脑区进行比较的神经影像学研究。值得注意的是，动物和人类的行为研究表明，运动序列学习会影响眼动表现，这表明眼动也会发生行为上的变化。然而，目前尚不清楚这些眼动表现中的行为变化是否与支持肢体运动表现变化相同的运动区域有关，因为控制眼睛和手部运动的区域在大脑中很接近且存在重叠。
功能神经成像使我们能够研究参与者在执行运动任务时，与特定行为相关的共激活脑区的参与情况。先前的研究表明，运动序列学习激活了纹状体皮层运动环路中的多个区域，包括初级运动皮层、前运动皮层、辅助运动区(SMA)和纹状体。尽管这些区域参与运动序列学习并通常与肢体运动系统相关，但额叶等区域也可能支持运动序列学习过程中的眼动表现。虽然基于任务的功能神经成像有助于我们理解人类行为背后的神经机制，但研究大脑静息态下的功能连接可能提供更多的见解，尤其是在揭示眼动系统与运动脑区在运动序列学习过程中的连接方面。此外，静息态功能磁共振成像(rs-fMRI)相较于任务态fMRI具有一定的优势，因为它能够对特定任务激活脑区以外的区域进行研究。
在这里，本研究探讨了以下区域的静息态功能连接(rsFC)：(i)眼动控制区域(额叶眼区[FEF]、顶叶眼区[PEF]和辅助眼区[SEF])和(ii)与眼动控制(FEF)及运动学习相关的候选区域(SMA、纹状体)，这些区域与眼动和肢体运动序列学习相关。以往的研究表明，额顶叶的眼动区域在扫视序列中被激活；因此，本研究评估了FEF、PEF和SEF之间的连接。值得注意的是，SEF位于额叶皮层的内侧壁，就在SMA前方，而SMA已被证明与肢体运动序列学习有关。虽然SMA在运动序列学习中的作用已被广泛认可，但由于SEF与SMA邻近，并且已有研究指出了它在眼动序列学习中的独特作用，因而SEF可能也在这种学习过程中起着重要作用。虽然沿着纹状体-皮层运动环路的多个区域对运动学习至关重要，但本研究重点关注该环路中的两个候选区域：纹状体和SMA。这两个区域已被证明在保持已学会的运动序列方面起着关键作用。纹状体对于编码运动程序是必不可少的，甚至在受试者达到稳定表现后仍然保持激活，这表明其参与了这些运动序列的获得和保持过程。这些发现表明，这些区域在维持和巩固已经掌握的运动技能方面发挥作用。基于先前研究强调FEF在预测行为中的作用及其与SMA和纹状体的空间差异，本研究评估了这些区域在运动序列学习中的连接性。此外，已有研究表明，FEF与皮层下的基底神经节区域相互连接，这表明它们之间的连接可能在运动序列学习中发挥作用。
本研究采用了两种不同的方法来评估静息态功能连接(rsFC)：(i)感兴趣区域分析(ROI分析)和(ii)网络分析。静息态网络(RSN)分析已被应用于运动序列学习研究。通过结合RSN分析，本研究旨在验证先前的研究结果，并探索在运动序列学习中与特定区域相关的网络之间的连接差异。此外，先前的研究表明，额顶叶网络以外的其他静息态网络(RSNs)也可能在运动学习中发挥重要作用。因此，本研究除了检测额顶叶RSNs外，还探讨了感觉运动和视觉RSNs。较高的基线网络功能(即在运动任务练习前)与更好的运动学习结果相关，而运动学习后网络强度增加，运动练习则没有这种变化。然而，表现的改善和与运动学习相关的行为变化已被发现与区域活动的增加和减少都有关联。区域激活增加被认为反映了额外神经资源的动员，而区域激活减少可能表示在已学会的行为中自动化程度提高，执行任务所需的资源减少。基于此，本研究假设：(i)在进行运动任务练习之前，较强的区域间(ROI-ROI)连接与运动序列学习相关的更大行为变化相关，(ii)随着练习的进行，从训练前到训练后的ROI-ROI连接将会减少，并且与运动序列学习相关的更大行为变化相关，(iii)运动序列学习后的网络连接性增强(训练后＞训练前)。为了检验这些假设，本研究使用静息态功能磁共振成像(rs-fMRI)来评估健康年轻成人在经历连续三天的左臂运动序列练习前后的区域及网络功能连接性。使用任务相关的fMRI来定位眼动控制区。评估了由运动序列学习引起的眼动(扫视)和手部动作(伸手)行为的变化。这使我们能够确定，眼动系统和肢体运动系统中与运动序列学习相关的行为变化是否与相似或不同的功能连接有关。
材料与方法
参与者
本研究招募了24名健康成人参与者(年龄在19至40岁之间，均为右利手)。排除标准为：(i)视力低于20/60(使用Snellen视力表测定)，(ii)有头部创伤史、重大精神疾病史、神经退行性疾病、视觉障碍或影响视运动任务表现的物质滥用史，(iii)存在MRI禁忌证。研究程序获得了不列颠哥伦比亚大学(University of British Columbia)研究伦理委员会的批准。所有测试均在不列颠哥伦比亚大学进行。所有参与者在参与本研究前均签署了知情同意书，遵循《赫尔辛基宣言》的原则。
实验设计
参与者在内隐运动序列学习任务训练前后接受了脑部MRI扫描，该任务在一个集成了SR Research Eyelink1000眼动仪的运动学仪器(KINARM，Kingston，ON，Canada)上进行的。训练包括连续三天的运动任务练习(间隔24小时，每天约15分钟)，在此过程中同时追踪了扫视眼动和手臂伸展(如图1所示)。第四天，在最后一次练习结束后24小时，采用保持测试来评估序列特异性运动学习。每个练习日包括4个手臂伸展block；每个block包含153个试次，即每天进行612次手臂伸展。保持测试包含1个block，共153个试次。在第一天进行(约1小时)运动任务练习前和第四天进行(约1小时)保持测试后进行MRI扫描。在第一次MRI扫描之前，参与者在KINARM设备上完成了一个扫视任务，以便熟悉扫描仪中的扫视任务执行情况。为了保持行为测试和神经影像学扫描时间的一致性，本实验将每名参与者的检查时间安排在大致相同的时间段(上午、下午或晚上)。在完成保持测试后，参与者还进行了再认测试，用于评估参与者是否明确记住了他们学习过的重复运动序列。再认测试包含10个试次，其中包括3个正确序列和7个干扰序列。为了测试再认记忆，参与者必须正确识别出3个序列中的2个为曾经见过的真实序列，并且从7个干扰序列中正确识别出4个为未曾见过的序列。
图1.实验设计。
内隐运动序列学习任务
该任务改编自传统的序列反应时任务，并针对KINARM设备进行了改进，称为序列目标任务(Serial Targeting Task，STT)。参与者执行离散的全臂伸展动作，任务是控制一个直径为1厘米的白色光标，以尽可能快速且准确地到达一个直径为2厘米的黄色目标；每个目标都会突然出现，一次一个。任务过程中会提供视觉反馈来标示是否成功到达目标(目标颜色从黄色变为橙色)，并要求参与者保持当前位置500ms，之后下一个目标才会出现。STT包含重复序列和随机序列。参与者事先不知道的是，重复序列中的目标遵循一个固定顺序的9元素序列(并且可以被学习)。重复序列与9目标的随机序列交替出现(随机序列无法被学习)。在练习过程中，重复序列在每个block中出现8次，而随机序列则在每个block中出现9次。随机序列和重复序列的因变量是反应时间(RT)，包括眼动扫视反应时间和手臂伸展反应时间。
MRI采集
在Philips Elition 3.0T扫描仪上进行结构和功能全脑MRI扫描。在训练前后分别进行T1加权(T1w)结构扫描和rs-fMRI扫描。T1w：多激发梯度快速自旋回波，压缩感知并行成像，TR=9.3ms，TE=4.3ms，翻转角=8°，0.8mm3各向同性体素，0mm间隙，视野=256×256×180mm，重建矩阵=320×320，225层，矢状位，扫描持续时间=5.8min。rs-fMRI：单次激发梯度回波平面成像，多波段因子为2，TR=2000ms，TE=30ms，翻转角=77°，2.5×2.5×2.5mm体素大小，2.5×2.5×2.5mm重建体素，0mm间隙，视野=240×240×155mm，重建矩阵=96×94，300个volume，62层，轴向，扫描持续时间=10min。在rs-fMRI扫描期间，要求参与者注视屏幕中央的固定十字点，并保持清醒。使用反向相位编码方向的图像对rs-fMRI扫描进行畸变校正(单次激发自旋回波平面成像，多波段因子为2，TR=2650ms，TE=55ms，翻转角=77°，2.5mm3体素，0mm间隙，视野=240×240×155mm，重建矩阵=96×94，62层，轴向，扫描持续时间=5s)。此外，在训练前的时间点，采用与rs-fMRI相似的参数进行任务态fMRI扫描，视觉刺激呈现在距离参与者眼睛约57cm处的屏幕上。
正反眼跳fMRI任务
为确定眼动控制区域的空间位置，采用了正向眼跳(prosaccade，或称朝向眼跳，是指眼睛朝向目标刺激出现的位置快速移动)和反向眼跳(antisaccade，是指眼睛快速移动到与刺激位置相反的方向)block设计任务。任务包括三个条件：两个活动条件和一个休息条件。在活动条件下，要求参与者进行扫视。在正向眼跳条件下，参与者在周边视觉刺激出现时立即进行扫视。在反向眼跳条件下，参与者需要抑制对周边视觉刺激的自然扫视反应，并转而注视与该刺激方向相反的点(即与当前周边刺激的方向相差180°)。活动条件的block顺序在实验前随机化，所有参与者看到的block顺序相同。每个活动block后都会呈现一个休息block，在此期间，要求参与者注视一个中央点并保持清醒。
每个活动block最初会呈现一个2s的指示屏，之后是10个试次，每个试次的呈现时间为2.5s，总时长约为30s。活动block之间间隔30s的休息block。每个试次由一个中央注视十字(持续0.5s)、提示(持续1s)和外周目标(持续1s)组成。提示用于提醒接下来的扫视试次类型。提示是一个呈现在屏幕中央的实心圆(直径2cm)，颜色为蓝色(反向扫视)或黄色(正向扫视)。参与者总共看到的是5个正向扫视、5个反向扫视和10个休息block。外周目标为一个实心圆(直径1cm)，位于屏幕中线的左侧或右侧，距离屏幕中线7cm(偏心度约±7°)(目标出现在左或右是随机的，但左右侧出现的频率相同)。
正反眼跳KINARM任务
为了确保参与者理解任务指令，并减少扫描过程中的操作误差，参与者在首次MRI扫描前约1小时，在扫描仪外完成了一个正向眼跳和反向眼跳任务。该任务在KINARM设备上进行，由80个交替进行的正向扫视和反向扫视试次组成(图2)。每个试次持续3s，整个测试过程约为4.5min。每个试次包括以下几个阶段：中央注视点(灰色圆圈，直径1cm，持续500ms)、空屏(250ms)、提示(蓝色或黄色实心圆圈，直径1cm，持续1000ms)、另一个空屏(250ms)、外周目标(实心灰色圆圈，直径0.5cm，持续1000ms)以及最后一个空屏(250ms)。在正式测试前，参与者进行了10个练习试次，以熟悉任务流程。要求参与者记住规则(蓝色提示表示反向扫视试次；黄色提示表示正向扫视试次)，并根据前面的提示尽可能快速且准确地执行相应的正向扫视或反向扫视。只有注视中央十字点至少500ms后才会触发试次。在测试前进行眼动校准，参与者需要分别注视测试屏幕上的9个目标点。
图2.正反眼跳KINARM任务。
fMRI分析
任务态和静息态fMRI扫描数据在fMRIPrep(v23.0.0)中进行预处理，并在FMRIB软件库(FSL v6.0.5.2)中进行后处理。
预处理
结构和功能(任务态和静息态)MRI数据最初均采用fMRIprep进行最小预处理。T1w体积数据进行了强度非均匀性校正和颅骨剥离。使用脑提取后的T1w体积数据和模板，通过非线性配准，将图像归一化到ICBM 152非线性不对称第6代(MNI152NLin6Asym)模板。对功能数据进行运动校正。使用反向相位编码图像进行畸变校正。计算每次功能扫描运行的帧间位移。采用基于独立成分分析(ICA)的自动去除运动伪影(AROMA)方法将数据分为噪声或信号成分。
两名评分者使用FSLeyes软件手动检查ICA-AROMA自动分类的成分及其相关的时间序列和功率谱，以确保这些结果的准确性。评分者间的一致性大于85%，AROMA错误分类的概率约为4%。预处理过的ICA-AROMA扫描数据随后进行了平滑处理(使用6mm半高全宽高斯核)、去噪和0.01Hz的时域高通滤波。
数据处理
任务态fMRI
使用FSL的FEAT对功能活动数据进行个体水平和组水平的分析。个体水平的图像使用包含3个回归因子的模型设计生成，每个因子对应任务的一个条件(正向扫视、反向扫视和休息)，并设定了7个对比(休息的均值、正向扫视的均值、反向扫视的均值、正向扫视＞休息、反向扫视＞休息、正向扫视＞反向扫视、反向扫视＞正向扫视)。使用混合效应模型(FSL的FLAME 1)对每个对比进行组水平的统计分析，使用Z=3.1，P＜0.05的聚类阈值。
rsFC ROI分析
使用组水平任务态fMRI结果中提取的ROI进行rsFC分析。基于反向扫视与正向扫视聚类分析结果中显著的局部最大值坐标，生成每个半球的额叶眼区(FEF)、辅助眼区(SEF)和顶叶眼区(PEF)ROI。采用球形ROI技术，在基于峰值激活的x、y、z坐标处创建了直径为5mm的球体ROI，并通过查阅先前的文献、使用解剖学标志以及在FSLeyes中查看大脑图谱来确认这些区域的位置。分别创建了左、右FEF区域，PEF区域，以及一个双侧SEF区域。此外，运动区域来自于以下脑图谱：辅助运动区(SMA)来自于Sallet图谱，纹状体(包括尾状核和壳核)来自于Oxford-Imanova纹状体连接图谱(7个子区域)。由于在训练中使用的是左侧非优势手，而且先前的研究表明，运动序列学习会导致对侧半球的活动偏侧化，因此在涉及这些运动区域的分析中，本研究使用了右侧半球的SMA和纹状体区域。使用FSL的fslmeants工具，从每个参与者rs-fMRI扫描(训练前和训练后)数据中提取每个ROI的平均时间序列。通过Pearson相关系数估计这些ROI之间的功能连接，使用Shapiro-Wilk检验来确定数据的正态性，并通过QQ图、箱线图和直方图进行可视化。本研究进行了两项独立的连接分析：(i)所有眼动控制区域对之间的连接，和(ii)眼动区域FEF与运动学习区域SMA以及纹状体之间的连接。rsFC分析中使用的ROI-ROI对列在表1中。
表1.rsFC分析中所使用的ROI-ROI对。
静息态网络fMRI
使用FSL中的melodic命令行工具进行组水平的独立成分分析(ICA)，以提取静息态网络(RSNs)，并提取了10个最主要的网络成分。使用以下方法对最能代表感觉运动网络、视觉网络和额顶叶网络的组水平成分进行统计推断：(i)一般线性模型，用于比较训练前后的rs-fMRI扫描(训练前＞训练后，训练后＞训练前)，(ii)使用FSL中的randomize工具进行非参数置换检验(5000次置换)，并且对每个对比进行了FWER校正和无阈值聚类增强。本研究主要感兴趣的是左右半球额顶叶静息态网络的连接性；此外，也探索了与运动学习相关的感觉运动和视觉静息态网络的连接性。由于本研究关注的是4个静息态网络的连接性增加，因此针对每个静息态网络的P值进行了进一步的多重比较校正[统计显著性水平设定为P＜0.0125(α=0.05/4)]。
统计分析
使用RStudio(v4.3.3)进行静息态功能连接(rsFC)比较的统计分析。通过相关分析，探讨了基线rsFC与序列特异性学习程度(眼跳反应时变化和伸手反应时变化评分)之间的关系，以及rsFC的变化(训练后减去训练前)与序列特异性学习程度(眼跳反应时变化和伸手反应时变化评分)之间的关系。对相关分析进行FDR多重比较校正。
结果
招募的24名参与者中有20名完成了研究。有4名参与者退出了研究，1名因MRI禁忌症退出，3名因个人原因退出。所有参与者均完成了KINARM正反眼跳任务。两名参与者在运动任务练习期间眼动追踪数据较差，另一名参与者的保持测试时间超过了24小时(由于最后一天的日程冲突导致)。因此，这三名参与者的数据被排除在外，最终纳入分析的为17名参与者(12名女性，平均年龄29±5岁，年龄范围为21-37岁)。对再认测试的事后分析结果显示，在17名参与者中，有7名能够正确识别重复序列和随机序列，且其识别准确率高于随机水平。分析表明，有外显意识和无外显意识的参与者在眼跳(P=0.353)和手部动作(P=0.538)的反应时间变化上没有显著差异，因此所有参与者均被纳入rsFC分析。静息态和任务态fMRI的平均帧间位移分别为0.12±0.04和0.11±0.03；因此，所有扫描均被纳入最终分析。参与者的激活图叠加如图3所示；个体激活图是通过反向扫视与正向扫视对比分析的输出结果获得的，并进行了二值化处理。个体二值化激活图的空间相似性使用FSL的fsl_cc进行量化，组平均空间相关性为0.36±0.04。伸手反应时数据通过Shapiro-Wilk正态性检验显示符合正态分布(P＞0.05)。眼跳反应时数据未通过Shapiro-Wilk正态性检验(P＜0.05)；因此，眼跳反应时的分析采用了非参数Spearman相关分析。rsFC分析中包含的ROI位置信息见表2，并在图4中展示。
图3.激活图叠加。
表2.rsFC分析中使用的ROI峰值坐标。
图4.用于rsFC分析的ROIs。
训练前的连接性
眼动rsFC
在训练前的扫描中，多个眼动区域的更强rsFC与眼跳和伸手任务中的更大序列特异性学习相关(表3；图5)。
表3.训练前连接和运动学习指标之间具有统计学意义的相关性。
图5.训练前的连接结果。
眼动-运动rsFC
与眼跳反应时(RT)或伸手反应时(RT)变化评分之间没有显著相关性。连接性结果如图7所示。
训练后-训练前的连接性
眼动rsFC变化
眼跳任务中的序列特异性学习程度越高，rFEF-lPEF(rho=0.56，P未校正=0.019，pFDR校正=0.096)、lPEF-SEF(rho=0.51，P未校正=0.035，pFDR校正=0.118)和rPEF-SEF(rho=0.62，P未校正=0.007，pFDR校正=0.074)之间的rsFC下降越明显。与伸手反应时(RT)变化无显著相关性。数据绘制于图6A中。
图6.连接结果的变化(训练后-训练前)。
眼动-运动rsFC变化
伸手任务中的序列特异性学习程度越高，rFEF-rStriatum(r=0.52，P未校正=0.031，pFDR校正=0.124)之间的rsFC下降越明显。与眼跳反应时(RT)变化无明显相关性。数据见图6B。连接性结果如图7所示。
图7.连接结果概况。
训练后-训练前的RSN连接性
使用ICA组水平分析检测RSNs在训练前后(post＞pre)的变化。右侧额顶叶网络和右侧视觉网络的连接性显著增加(表4；图8)。在显著的RSNs中被激活的ROI列在了补充材料中(详见补充表1)。左侧额顶叶网络或感觉运动网络无显著变化。
表4.静息态网络连接结果。
图8.运动序列学习后，静息态网络的功能连接性增强。
结论
本研究表明，眼动行为和运动行为变化与相关脑区的功能连接性之间存在显著关联。虽然网络分析结果显示，额顶叶网络和视觉网络在运动学习后发生了变化，但ROI-ROI分析进一步揭示了，不同眼动区域(包括基线和rsFC的变化)与眼跳和伸手的运动序列学习密切相关。值得注意的是，右半球(训练臂的对侧)额叶眼区与其他区域之间的连接经常出现，这表明它可能在眼动和肢体运动系统的运动序列学习中发挥着重要作用。
参考文献：Cristina Rubino, Justin W Andrushko, Shie Rinat, Adam T Harrison, Lara A Boyd, Oculomotor functional connectivity associated with motor sequence learning, Cerebral Cortex, Volume 34, Issue 11, November 2024, bhae434, https://doi.org/10.1093/cercor/bhae434
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