生信自学路线｜转录组bulkRNA-seq的处理与常见下机测序数据分析

本篇面向新入门的，转专业的，临床的，0基础的同学。学生信对于软件安装没问题了，环境搭建好了，开始了解一些数据挖掘的常见概念，以下是生信多组学数据挖掘四大金刚为首的转录组，我们先讲bulkRNA哈，下一步才做scRNA！！
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常见概念问题

以下为 bulkRNA-seq 初学者或项目中常见的基础问题，建议逐一搞清楚背后逻辑：

1. 芯片数据与测序数据（microarray vs RNA-seq）有何区别？
2. bulkRNA-seq 与 单细胞 RNA-seq 的根本差异是什么？
3. GEO、TCGA、ArrayExpress 等数据库的用途与区别？
4. Illumina、Agilent、Affymetrix 等测序/芯片平台有何不同？
5. 什么是表达矩阵？FPKM、TPM、counts 有何不同？
6. 上游分析 vs 下游分析分别指什么？
7. limma 与 DESeq2 的差异和适用场景？
8. 差异分析中常用的过滤标准（如 logFC、FDR）是什么？
9. **批次效应（batch effect）**是如何产生的？如何处理？
10. **临床信息文件（clinical/phenotype）**如何与表达矩阵对应？
11. 如何根据 GPL 平台转换探针 ID 为 基因名？
12. 富集分析中 GO / KEGG / GSEA 有何区别？
13. 富集分析用基因集应如何准备？输入格式有何要求？
14. 气泡图和柱状图分别适用于哪类富集结果展示？
15. 常见可视化 R 包有哪些？（如 ggplot2、pheatmap、clusterProfiler）
16. 什么是 log2(TPM+1) 或 logCPM 转换？为什么要 log 转换？
17. 为什么差异分析需要建模？如何理解设计矩阵（design matrix）？
18. 如何评估差异分析结果是否可信？（如 PCA、聚类图 等）
19. 表达量低的基因是否需要过滤？常见的过滤标准是什么？
20. 如果一个项目样本量很小，还能做差异分析吗？有哪些注意事项？
21. **表达量归一化（normalization）**常见方法有哪些？分别适用于哪类数据？
22. 如何进行样本聚类与可视化？聚类方法和距离公式有何差异？
23. 如何设置合理的 contrast 对比组？如何解释 fold change 的方向？
24. RNA-seq 数据是否适合做机器学习？有哪些前处理步骤？
25. 什么是 表达谱可视化？常用图有哪些？如何美化？
26. 如何区分技术重复与生物重复？差异分析中如何正确设置？
27. **样本混杂因素（confounders）**有哪些？如何在建模中控制？
28. 富集分析中的**背景基因集（background）**如何设置才合理？
29. 如何从差异分析结果中筛选出具有生物学意义的核心基因？常用标准有哪些？
30. bulkRNA-seq 能否用于预测临床结局（如生存分析、分型）？如何与临床变量结合？

实操演练模块

1. GEO 数据处理基础

• 数据集：GSE194331
• 样本量：119 个外周血 RNA-seq 样本
• 分组信息（病情分级）：
  • Mild AP（轻度）：57 例
  • Moderately-Severe AP（中度）：20 例
  • Severe AP（重度）：10 例
  • Healthy Controls（健康对照）：32 例
• 平台编号：GPL16791（Illumina HiSeq 2500）

作业要求：

• 输出行为基因，列为样本的表达矩阵，txt和csv都可，基因名称需为symbol ID；
• 整理出一一对应的分组表格，第一列为样本名称，第二列为分组信息；

2. TCGA 数据下载与预处理

• 项目名称：TCGA-LUAD（肺腺癌）
• 数据类型：RNA-seq 原始计数（HTSeq - Counts）
• 样本来源：TCGA 数据门户（GDC）
• 样本类型：包含肿瘤组织（Tumor）和配对正常组织（Normal）

作业要求：

• 能在TCGA官网下载处理更好，这里用xena的数据也是可以的，GDC/TCGA都可
• 输出行为基因，列为样本的表达矩阵，txt和csv都可，基因名称需为symbol ID；
• 整理临床信息表格，包含性别、年龄、生存时间、生存状态、stage、T、M、N、是否治疗、是否转移

3. 多队列 GEO 数据整合与批次效应校正

• 数据集 1：GSE75037
  • 样本数：83 对肺腺癌肿瘤与邻近非肿瘤组织（共 166 个样本）
  • 平台：Illumina WG6-V3 expression arrays
• 数据集 2：GSE10072
  • 样本数：58 个肺腺癌样本 + 49 个配对非肿瘤组织样本（共 107 个）
  • 平台：Affymetrix HG-U133A Array
• 分析目标：合并两个芯片表达数据集，构建统一表达矩阵，并进行批次效应校正

作业要求：

• 两个分别的表达矩阵（标准化后，行为基因），合并后的统一表达矩阵（去批次效应）
• 分组信息表，包含样本名称、GSE号、肿瘤分组
• 校正前后 PCA 或者 聚类图

👆【图片仅供参考，与结果无关】👆

4. 差异表达分析与可视化

• 项目：TCGA-LUAD（肺腺癌）
• 样本：Primary Tumor 与 Solid Tissue Normal
• 数据类型：HTSeq-counts（推荐）或 FPKM/TPM（需说明转换方式）
• 分析目标：识别肿瘤与正常组织之间的差异表达基因，并进行可视化展示

作业要求：

• 差异分析结果表（包含完整表格、筛选fc/p值后）
• 差异热图、差异火山图

👆【图片仅供参考，与结果无关】👆

5. 富集分析与可视化展示

• 数据来源：第 4 步差异表达分析结果
• 分析目标：识别差异表达基因所涉及的功能通路（GO/KEGG）和富集趋势，并进行可视化展示
• 使用工具包：clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2

作业要求：

• GO 富集结果表、KEGG 富集结果表
• GO（BP、MF、CC分组）和 KEGG 可视化图片，气泡图柱状图都可以，x 轴展示基因个数

👆【图片仅供参考，与结果无关】👆

📌 补充建议：每个小作业记得保存好自己的代码+真实数据+可视化图片，方便复现，以及后续优化自己的可视化形式与配色等。