胶质母细胞瘤（GBM）是恶性程度最高的脑肿瘤，具有高度异质性和浸润性。传统病理学已经描绘了胶质母细胞瘤（GBM）的空间异质性，尤其是假栅栏结构对应的坏死灶/缺氧区被认为是局部组织的关键调控者，但其长程的空间调控机制未知，缺氧如何协调不同细胞类型的空间分布规律。虽然scRNA-seq解析了GBM恶性细胞的四大状态（NPC/OPC/AC/MES）及IDH突变亚型状态，但是组织解离导致了空间信息丢失，scRNA-seq无法捕捉缺氧/坏死相关状态，并且细胞互作网络仅能间接推测。因此GBM细胞状态是否存在空间组织规律？空间位置如何影响细胞状态分化？微环境如何介导状态间互作？这些问题一直悬而未决。为了解析GBM复杂的空间结构，《Cell》上发表了一项题为“Integrative spatial analysis reveals a multi-layered organization of glioblastoma”的论文。该研究结合Visium空间转录组和PhenoCycler-Fusion空间单细胞蛋白组（CODEX），系统解析了GBM细胞状态的空间分布规律，揭示了缺氧在驱动肿瘤组织层级结构中的作用。
研究设计
Visium空间转录组
分析19例胶质瘤（13例GBM，6例IDH突变型），生成70,618个spots的转录组数据。通过拷贝数变异（CNA）推断恶性区域，结合Leiden聚类和非负矩阵分解（NMF）识别基因表达程序。
PCF空间单细胞蛋白质组
使用40种抗体的panel对12例GBM样本进行空间单细胞分辨率成像，验证Visium结果并补充低丰度细胞类型信息，构建高精度的细胞互作网络。
主要研究结果
1.细胞类型的注释
恶性细胞类型的定义上，Visium的spot代表的类型和PCF定义的单细胞类型基本相符，包括神经发育状态（NPC-like、OPC-like、AC-like）、间充质状态（MES-like、MES-Hyp）和增殖代谢（Prolif-Metab）、染色质调控（Chromatin-Reg）等状态。但是PCF定义了Visium无法识别的低丰度细胞，特别是关键的T和B细胞。Visium分辨率不足（每点含1-35细胞），难以解析稀有状态，这些免疫细胞在GBM中的含量很少，其在Visium中每个spot中的RNA丰度很低，因此Visium很难捕获，无法诠释这些低丰度细胞。但是PCF基于抗体检测，可以直接检测感兴趣的细胞类型。
2. GBM的空间组织模式
研究者实现了Visium和PCF结果的邻片对齐，利用PCF的单细胞结果验证了Visium中每个spot结果并补充了低丰度细胞的信息。通过整合Visium和PCF，揭示了GBM的三维空间组织模式。结果发现了GBM存在有序区域和无序区域，其中有序区域呈现五层组织架构，由缺氧梯度驱动。而无序区域内细胞状态混杂，缺乏缺氧信号。IDH突变型胶质瘤因缺氧缺失而多为无序区域。
研究者进行了不同像素水平的细胞互作分析，揭示了有序区域中缺氧的核心调控作用。MES-Hyp状态在缺氧核心富集，并通过分泌因子驱动周边和远端细胞状态（MES-like、MES-Ast）的分层排列和互作模式。神经发育型的恶性细胞（NPC-like, OPC-like, AC-like）与正常脑细胞互作。间充质型（MES-like, MES-Hyp, MES-Ast）与免疫细胞互作，其中MES-Ast区富集T细胞（免疫激活），MES-Hyp区富集炎性巨噬细胞（免疫抑制）。
3.GBM的五层空间模型
研究通过整合分析Visium和PCF，建立了胶质母细胞瘤的缺氧驱动五层架构模型，揭示了肿瘤组织的空间组织原则。将传统病理特征（如假栅栏坏死）与分子细胞状态的空间逻辑关联，重新定义了胶质瘤微环境认知范式。
五层空间结构：
L1（缺氧核心）：MES-Hyp主导，伴随坏死。
L2（缺氧相关）：MES-Ast和炎性巨噬细胞，介导免疫抑制。
L3（血管-免疫枢纽）：血管内皮细胞（Vasc）与增殖代谢状态（Prolif-Metab）共定位，支持血管生成。
L4（神经发育恶性状态）：OPC-like、NPC-like等浸润性状态。
L5（脑实质浸润）：正常神经元和少突胶质细胞，反映肿瘤侵袭边界。
总结与讨论
该研究实现了Visium（高基因覆盖）与PCF（高空间分辨率）的互补。通过空间关联分析推导肿瘤组织的层级结构，揭示了缺氧的核心调控作用。突出了缺氧不仅驱动恶性表型，还组织全局空间结构，可能影响治疗抵抗。体现了分层模型的诊断价值，补充传统病理，为分子分型和预后评估提供了新维度。
华盈生物空间多模态研究体系
PCF空间单细胞蛋白组成像示例
相关文献
Greenwald AC, Darnell NG, Hoefflin R, Simkin D, Mount CW, Gonzalez Castro LN et al. Integrative spatial analysis reveals a multi-layered organization of glioblastoma. Cell. 2024;187(10):2485-2501.e26.